Fare Testisinde ve Leydig Hücre Hatlarında Endoplazmik Retikulum İle İlişkili Protein Yıkımının (ERAD) Steroidogenez ile İlişkisinin Belirlenmesi

Abstract

ERAD ve steroidogenez ile yapılan son çalışmalarda ERAD'ın androjenlerce regüle edildiği ortaya konulmuştur. Özellikle ERAD proteinlerden SVIP'in, ERAD inhibitörü olduğu literatüre geçmiştir. Fakat bu zamana kadar ERAD proteinlerinin steroidogenez basamaklarında yer alan proteinlerle etkileşimleri ve ya onların ekspresyonlarını nasıl etkiledikleri konusunda bir çalışma yapılmamıştır. Bu bilgiler ışığında tezimde fare testis dokusunda ve Leydig hücrelerinde, ERAD proteinlerinin steroidogenez sürecindeki rollerine açıklık getirmek amacı ile SVIP, p97/VCP, StAR, CYP17A1 ve 3β-HSD'nin ekspresyonları immünfloresan, immünohistokimya, ko-immünopresipitasyon, Western blot, Gen Ekspresyonu Analizi/QRT- PCR ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir. StAR'ın, CYP17A1'in ve 3β-HSD'nin, SVIP ve p97/VCP ile Leydig hücrelerinde kolokalize olduğu belirlendi. MA10, TM3 ve HLC Leydig hücrelerinde SVIP siRNA'ler ve p97/VCP siRNA'ler ile protein ekspresyonlarının baskılanması sonucunda CYP17A1, 3β-HSD ve StAR ekspresyonlarında azalma gözlenmiştir. İnsan Leydig hücrelerinde SVIP siRNA ile transfeksiyon ve hücrelerin hCG ile muamelesi sonrasında SVIP protein ekspresyonunda anlamlı artış gözlenirken, CYP17A1, 3β-HSD ve StAR ekspresyonlarında anlamlı bir değişiklik saptanmamıştır. p97/VCP siRNA ile transfeksiyon ve hücrelerin hCG ile muamelesi sonrasında ise p97/VCP, CYP17A1, 3β-HSD ve StAR protein ekspresyonlarında anlamlı bir değişiklik saptanmamıştır. Kontrol siRNA, SVIP siRNA ve p97/VCP siRNA ile transfekte edilmiş İnsan Leydig hücrelerinde SVIP ve p97/VCP gen ekspresyonlarında anlamlı düşüş gözlenirken, CYP17A1, 3β-HSD ve StAR gen ekspresyonlarında anlamlı değişiklik gözlenmemiştir. p97/VCP proteini çöktürülen HLC Leydig hücrelerinde StAR, CYP17A1 ve 3β-HSD ile bu proteinlerin p97/VCP ile etkileşimde oldukları belirlenmiştir. İnsan Leydig hücrelerinde Kontrol siRNA, SVIP siRNA ve p97/VCP siRNA ile transfekte edilmiş hücre medyumlarındaki testosteron düzeyleri karşılaştırıldığında, SVIP siRNA ve p97/VCP siRNA ile transfekte grupta testosteron düzeylerinde anlamlı derecede azalma görülmüştür. SVIP siRNA ile transfeksiyon ve hCG ile muamele sonrası testosteron düzeyleri SVIP siRNA ile transfekte grupla karşılaştırıldığında anlamlı derecede artış belirlenmiştir. Sonuç olarak diyebiliriz ki; ERAD'a ait proteinlerden SVIP ve p97/VCP Leydig hücrelerinde steroidogenezi etkiler, SVIP ve ve p97/VCP testosteron sentez sürecinde rol oynamaktadır.

In recent studies with ERAD and steroidogenesis, it has shown that ERAD is regulated by androgens. It has reported that SVIP is ERAD inhibitor. There was no study conducted on interactions of ERAD proteins with proteins involved in steroidogenesis. We investigated expressions of SVIP, p97/VCP, StAR, CYP17A1 and 3β-HSD in mouse testicular tissue and Leydig cells to determine roles of ERAD proteins in steroidogenesis by immunofluorescence, immunohistochemistry, co-immunoprecipitation, Western blot, qRT-PCR and ELISA. We found StAR, CYP17A1 and 3β-HSD were colocalized with SVIP and p97/VCP in Leydig cells. A decrease in CYP17A1, 3β-HSD and StAR expressions was observed as a result of suppression of SVIP siRNAs and p97/VCP siRNAs expressions in MA10, TM3 and HLC in Leydig cells. While significant increase in SVIP expression was observed after transfection with SVIP siRNA and treatment of cells with hCG, there was no significant change in CYP17A1, 3β-HSD and StAR protein expressions after transfection with p97/VCP siRNA and treatment of cells with hCG in human Leydig cells. While significant decrease in gene expressions of SVIP and p97/VCP was observed in human Leydig cells transfected with control siRNA, SVIP siRNA and p97/VCP siRNA, no significant changes were observed in CYP17A1, 3β-HSD and StAR. StAR, CYP17A1 and 3β-HSD in HLC cells that were precipitated with p97/VCP, and it has determined that these proteins interact with p97/VCP. When testosterone levels were compared in cell media of transfected with control siRNA, SVIP siRNA and p97/VCP siRNA in human Leydig cells, significant decrease in testosterone levels was observed in SVIP siRNA and p97/VCP siRNA transfected groups. Testosteron levels were significantly increased after transfection with SVIP siRNA and treatment with hCG compared to transfected group with SVIP siRNA. We can say that; SVIP and p97/VCP, affect steroidogenesis in Leydig cells and SVIP and p97/VCP play role in testosterone synthesis.